John Singleton suit des études de cinéma à l’University of Southern California, où il est le lauréat, à la fin des années 80, de trois bourses d'écriture, le Jack Nicholson Award en 1989 et en 1990 et le Robert Riskin Award en 1989.Lors de sa dernière année d'études, il rejoint la Creative Artists Agency et vend le scénario de Boyz'n the Hood, chronique des difficultés sociales d'une bande de jeunes dans un ghetto de Los Angeles, qu'il réalise en 1991 et qui fut une véritable révélation.Il devient le plus jeune artiste et le premier afro-américain cité conjointement à l'Oscar du Meilleur réalisateur et du Meilleur Scénario. Ce succès critique et populaire lui vaut également de nombreuses récompenses dont le LAFCA New Generation Award, le MTV Movie Award, le New York Film Critics Circle Award du meilleur jeune réalisateur, le ShoWest Award du Scénariste de l'Année et un prix spécial du Meilleur Débutant de l'Année.Parrainé par Spike Lee, que John Singleton considère comme son père spirituel, le cinéaste tente de retrouver la veine de ce premier coup d'éclat avec le drame Poetic Justice en 1993, où il met en scène Janet Jackson et Tupac Shakur, ainsi que dans Higher learning deux ans plus tard, sans jamais retrouver les faveurs critiques et publiques de son tout premier scénario.En 1997, il tourne Rosewood, chronique d'un massacre qui endeuilla une petite communauté de Floride dans les années 20. Le film obtient une mention à l'Ours d'Argent du Festival de Berlin.
En 2000, il renoue avec le succès en offrant une nouvelle jeunesse au personnage mythique de John Shaft, figure emblématique du cinéma black des années 70, incarné par Samuel L. Jackson et présenté en avant-première au Festival de Deauville.Ensuite il reprend les commandes laissées vacantes par Rob Cohen pour tourner la suite du film d'action Fast and Furious, Fast and Furious 2, avec lequel il signe un nouveau succès au box-office.L’année suivant, dix ans après sa plongée dans les violences de South Central, il produit, écrit et réalise Baby Boy, dont la distribution réunit le comédien et chanteur de R&B Tyrese Gibson, Snoop Dogg et Taraji P. Henson. Le film recevra quatre citations de la National Association for the Advancement of Colored People.John Singleton réalise également des spots hauts de gamme pour Coca-Cola, AT&T et Burger King, des vidéos musicales pour Michael Jackson et assure en 1998 la production exécutive du film de Daisy Von Scherler-Mayer, Woo, interprété par Jada Pinkett Smith.Sa plus récente production, Hustle & Flow, avec Terrence Howard, obtient le Prix du Public au Festival de Sundance 2005. La même année, il revient au polar urbain avec Quatre frères dans lequel il dirige une nouvelle fois Tyrese Gibson.En 2011, il revient avec un thriller, Identité secrète, porté par le jeune Taylor Lautner.
